Modelo macrófago humano-amastigote para la identificación de aislados quimio-resistentes de leishmania, prueba de concepto / A human macrophage-amastigote model for chemo-resistant isolates identification in Leishmania, a proof of concept

Este trabajo utilizó un modelo macrófago humano-amastigote como herramienta para recrear in vitro la infección causada por aislados de pacientes con fracaso terapéutico y valorar su utilidad en la identificación de aislados de Leishmania con fenotipo quimio-resistente. Objetivos: (1) Evaluar un modelo in vitro de macrófago humano-amastigote y (2) Determinar su utilidad en la identificación de aislados de Leishmania con fenotipo quimio-resistente. Métodos: Se evaluó un protocolo de purificación basado en la capacidad de los monocitos de adherirse al plástico. Monocitos purificados de sangre humana fueron infectados con promastigotes metacíclicos de especies de referencia y aislados de Leishmania de tres pacientes con falla terapéutica a antimoniales. Se determinó el porcentaje de infección inicial y el efecto leishmanicida de glucantime, anfotericina­B y pentamidina; se correlacionó la capacidad leishmanicida con los niveles de producción de óxido nítrico en cada condición estudiada. Resultados: Los resultados sugieren que el modelo macrófago humano-amastigote empleado recrea in vitro la infección causada por especies de referencia, o con aislados de pacientes con fracaso terapéutico. Adicionalmente sugieren que en monocitos infectados (1) con el aislado VE98MR no puede definirse una IC50 para glucantime ni para pentamidina y (2) con el aislado VE96ZC no puede definirse una IC50 para glucantime mas si para pentamidina. De igual forma, se evidencia una disminución efectiva del porcentaje de infección susceptible a anfotericina-B, para todos los aislados y cepas de referencia. El efecto leishmanicida no se correlaciona con aumentos significativos de la producción de óxido nítrico. Conclusiones: El modelo macrófago humano-amastigote empleado constituye una prueba de concepto que permitió identificar como aislados potencialmente quimio-resistentes a L. (L.) amazonensis (VE98MR) y L. (L.) mexicana (VE96ZC), mas no al aislado L. (L.) amazonensis (VE2000MM)(AU)

This work used a human-amastigote macrophage model as a tool to recreate in vitro infection caused by isolates from patient's with therapeutic failure and assess its usefulness in the identification of chemo-resistant Leishmania isolates. Objectives: (1) Evaluate in vitro a human-amastigote macrophage model and (2) determine its usefulness in the identification of Leishmania isolates with chemo-resistant phenotype. Methods: A purification protocol based on the ability of monocytes to adhere to plastic was evaluated. Monocytes purified from human blood were infected with metacyclic promastigotes of reference species and Leishmania isolates from three patients with antimonial therapeutic failure. The percentage of initial infection and the leishmanicidal effect of glucantime, amphotericin-B and pentamidine were determined; the leishmanicidal capacity was correlated with the levels of nitric oxide production in each condition studied. Results: Results suggest that the human-amastigote macrophage model recreates in vitro the infection caused by reference species, or isolates from patients with therapeutic failure. In addition, they suggest that (1) an effective IC50 for glucantime and pentamidine could not be defined in monocytes infected with the isolate VE98MR and (2) an effective IC50 for pentamidine but nor for glucantime could be defined in monocytes infected with the isolate VE96ZC. On the contrary, an effective decrease in the percentage of infection susceptible to amphotericin-B was observed for all isolates and reference strains. The leishmanicidal effect did not correlate with significant increases in nitric oxide production. Conclusion: The human-amastigote macrophage model used constitutes a proof of concept to identify as potentially chemo-resistant isolates L. (L.) amazonensis (VE98MR) and L. (L.) mexicana (VE96ZC), but not L (L.) amazonensis (VE2000MM)(AU)

Modulación de la expresión del asa de regulación hierro libre-óxido nítrico sintetasa de células dendríticas por quelantes de hierro / Modulation of expression of the regulatory loop of iron-free nitric oxide synthase by dendritic cells to iron chelators

El papel de las células dendríticas es fundamental en la señalización de la infección por Leishmania desde la piel hasta los ganglios linfáticos; sin embargo, la proliferación de Leishmania en estas células está restringida. En el macrófago, célula hospedera de Leishmania por excelencia, los parásitos proliferan irrestrictamente y el control de la infección depende directamente de los niveles de óxido nítrico. Debido a que la disponibilidad de hierro celular modula la actividad de la enzima óxido nítrico sintetasa del macrófago y para analizar las causas de la restricción de la proliferación de Leishmania en células dendríticas, en este trabajo evaluemos la influencia del hierro libre intracelular sobre la funcionalidad de células de dendríticas y la infección por Leishmania major. Los resultados demuestran que la en células de Langerhans de la piel expuestas a quelantes de hierro la infección por Leishmania major y la expresión del receptor de transferina disminuyen, sin alterar la producción de óxido nítrico y las otras propiedades funcionales de la célula. La incubación de células dendríticas de médula ósea con quelantes de hierro no afecta la infección por Leishmania major ni la producción de óxido nítrico de la célula. Estos resultados demuestran que la restricción de la proliferación de Leishmania en células dendríticas es independiente de los niveles de hierro celular y de los niveles de óxido nítrico.

El lipofosfoglicano de Leishmania major modula la expresion de receptores involucrados en la internalización del parasito en celulas de Langerhansde la piel / Leishmania major lipophosphoglycan modulates the expression of receptors involved in parasite internalization in skin Langerhans cells

Debido a la importancia demostrada de las células de Langerhans (LC) de la piel, que al ser expuestas a antígenos los fagocitan y adquieren la capacidad de presentarlos a los linfocitos T, en el presente trabajo exploramos si el lipofosfoglicano (LPG), el glicolípido más abundante en la superficie de Leishmania afecta la expresión de receptores de superficie asociados a la entrada de los parásitos a sus células hospederas. Los datos sugieren que la exposición de LC al LPG trae consecuencias que implican cambios en su función como célula presentadora de antígenos. La incubación de LC con LPG disminuye en pocas horas la expresión de la cadena gamma del receptor Fc y del antígeno CD1, sin afectar la expresión de las cadenas alfa y beta del receptor LFA-1. Estos cambios se producen también en LC expuestas a un medio condicionado por Leishmania lo cuál sugiere que los efectos pueden ser mediados por el dominio de carbohidratos del LPG, factor soluble liberado por el parásito al medio de cultivo al final de su fase de crecimiento. Los cambios en la expresión de las moléculas de superficie inducidos por la exposición de las LC al LPG, reflejan alteraciones en la capacidad fagocítica de la célula y sugieren una modificación en la capacidad de señalización de las LC desde la piel infectada. Estos resultados son extremadamente importantes a la luz del papel que las LC pudieran jugar en procesos de auto-vacunación e inmunoterapia

Despite the immunological changes recognized to be produced during Leishmania infection and the central role played by Langerhans cells, it is not known whether Leishmaina lipophosphoglycan, the most abundant glycolipid on the parasite surface, affects the functions of Langerhans cells. Here, we provide evidence that exposure of Langerhans cells to Leishmaina (L.) major lipophosphoglycan has consequences for the expression of surface receptors. Down-regulation of receptors involved in host cell-parasite interaction are observed after 4 h exposure of Langerhans cells to lipophosphoglycan. Many of the changes are also induced in Langerhans cells incubated with L. major-conditioned medium, indicating that the observed effects may be mediated by soluble factors released by the parasite into the culture, as it is the case for the carbohydrate moiety of lipophosphoglycan. Taken together, these results indicate that the changes in surface molecule expression induced by the exposure of Langerhans cells to lipophosphoglycan might reflect changes in their signalling functions from the infected skin

Postgrado en ciencias fisiologicas de la facultad de medicina de la universidad central de venezuela: XXV años de historia / Graduate program on physiological sciences of the school of medicine of the central university of Venezuela: XXV years of history

El Postgrado en Ciencias Fisiológicas, primer programa de Maestría y Doctorado fundado en la Facultad de Medicina, arribó en 1998 a sus 25 años de edad. En estas páginas queremos describir y analizar, muy brevemente, los acontecimentos que han signado su crecimiento y que han regido su carácter pionero en relación a los estudios de cuarto nivel dentro de la Facultad de Medicina de la Universidad Central de Venezuela y el país. Señalamos también lo propuesto para hacer en el futuro.

Sensitivity of Leishmania spp. to glibenclamide and 4-Aminopiridine: a tool for the study of drug resistance development

We have demonstrated that Leishmania spp. grown as promastigotes, are sensitive to the K+ channel inhibitors 4-aminopyridine and glibenclamide. Their host cells, the macrophages, are not affected by similar concentrations of the drugs. We have also initiated the molecular characterization of the mechanisms involved in the development of drug resistance to glibenclamide by the parasite. Therefore, we have selected experimentally and begun to characterize the Venezuelan Leishmania (Leishmania) strain, NR resistant to glibenclamide [NR(Gr)]. The analysis of genomic DNA evidenced the existence of a fragment which apparently is amplified in NR(Gr). The fragment recognized by the pgpA probe, related to the Leishmania P-glycoprotein family and which was originally isolated from L. tarentolae, showed a size polymorfism between the sensitive and the resistant strain. These results suggest that the development of resistance to glibenclamide in the strain NR(Gr) might be associated with the amplification of the ItpgpA or related gene(s).

Control de la actividad de la piruvato quinasa en leishmania: una herramienta farmacológica? / Control of activity of the piruvate kinase in leishmania: is an pharmacologic tools?

El estudio del metabolismo energético de Leishmania debe tomar en cuenta su ciclio de vida digenético. Para los promastigotes de algunos Trypanosomatidae, entre ellos Leishmania, se han descritos todas las enzimas de la vía glicolítica y del ciclo de Krebs, un sistema de fosforilación oxidativa y la cadena de transporte de electrones; sin embargo, la glucosa es un substrato de segunda importancia metabólica y la fermentación aeróbica es mas importante en las fases estacionarias que en las fases exponenciales de crecimiento. Estas diferencias con la glicólisis en mamíferos, sugieren que los mecanismos regulatorios complejos clásicos, deben estar disminuidos o ausentes en estos organismos. Sólo la enzima piruvato quinasa parece estar regulada y este hecho, además de su exclusiva localización cristosólica sugieren su posible papel en el control del catabolismo de los carbohidratos y aminoácidos y hacen pensar que pudiera servir como objetivo estratégico para diseñar agentes quimioterapéuticos de forma racional.

Fructose 2, 6 bisphosphate promotes the monomer-tetramer conservation of Leishmania mexicana amazonensis pyruvate kinase type two

The enzyme pyruvate kinase of Leishmania mexicana amazonensis presents two forms with different kinetic properties and behavior for the heterotrophic activator fructose 2,6 bisphosphate. Pyruvate kinase 1, which is isolated as a tetramer, is inhibited by this metabolite. The second activity, Pyruvate kinase 2, is activated by fructose 2,6 bisphosphate, which promotes the monomer-tetramer conversion of this enzyme

Los inositoles de la membrana celular y el efecto del Li+ sobre el desarrollo embrionario / The inositols of the cellular membrane and the effect of Li+ in the development of the embryo

El Li+ tiene la capacidad, en embriones sanos, de inducir la formación supernumeraria de estructuras cefálicas y de revertir las deficiencias del eje neural que se evidencian en embriones expuestos a la luz ultravioleta. Por otra parte, la hidrólisis de los fosfoinositodos de la membrana se ha implicado en los aumentos de Ca2 que proceden a los eventos que se suceden durante la fertilización y el desarrollo embrionario y el Li+ impide que los niveles de fosfoinositol (4,5), bifosfato retornen a sus niveles normales. La conclusión a la cual se debe llegar es que el Li+ altera la reespecificación dorsoanterior de los embriones y que esto debe depender de su capacidad de interferir con el ciclo de los fosfoinositidos. Estas observaciones tienen relevancia particular puesto que los efectos específicos del Li+ sobre el ciclo de los fosfoinositidos permiten suponer que alguno de los intermediarios de este ciclo debe jugar un papel importante en la diferenciación y especificación dorsoanterior del embrión. Es preocupante el hecho de que estos efectos pueden obtenerse utilizando concentraciones de Li+ similares a las usadas terapéuticamente en el manejo de las enfermedades maniacodepresivas

NaCl increases the dissociation constant (Koff) of 3H-QNB muscarinic receptor complex in an airway smooth muscle plasma membrane fraction

Muscarinic receptors associated to plasma membrane fractions isolated from bovine airway smooth muscle were previously characterized by using 3H Quinuclidinyl-benzilate (3H-QNB) binding (Bécemberg, et al. Arch. Venez. Farm Terap. (1986) 5: 244-256). 3H-QNB binding to P1 plasma membrane fraction was time dependent. In order to study the effect of NaCl on the ligand binding properties of muscarinic receptor, a kinetic approach for the evaluation of koff of the 3H-QNB muscarinic receptor complex (QNB-mR) perfomed in the presence or absence of NaCl is done. The 3H-QNB bound to the receptor is released by atropine through an exchange reaction at the antagonist binding site. NaCl decreases the t1/2 of complexes and increases the velocity of dissociation of 3H-QNB-mR producing a significant change in Koff values, whichever conditions the 3H-QNB-mR complexes are formed. Pretreatment of P1 plasma membranes fraction with N-ethyl maleimide (1mM NEM) does not alter Koff value. In addition, in these NEM-treated P1 membranes, NaCl is unable to further increase the Koff value. The effect of NEM blocking this "activator effect" of NaCl suggests thar sulphydryl groups in the receptor structure may be involved in this NaCl effect on the 3H-QNB binding to muscarinic receptors

Muscarinic activation of phosphatidylinositol breakdown in neuroblastoma cells

Hydrolisis of phosphatidylinositol (PtdIns) has been shown to occur as a consequence of muscarinic activation in pancreas and salivary glands and has thus been proposed as a step in the sequence of muscarinic activation in general. Since a role of such a mechanism in the central nervous system has not been determined, neuroblastoma cells in culture were used in the present investigation to explore the relationship between phosphoinositide metabolism and muscarinic receptor activation. It was found that 10-3 M and 10-8 M carbachol causes a decrease in the amount of label associated with [3H] phosphatidylinositol within 30 seconds. Furthermore, 10-5 M atropine sulfate selectively blocks this response, indicating the muscarinic nature of the effect. These results suggest that phosphatidylinositol metabolism could be an early step in muscarinic receptor activation and that neuroblastoma cells provide a suitable model to study the biochemical mechanism of cellular activation by muscarinic receptors in the central nervous system

La actividad de enlace del receptor muscarínico: influencia de los iones monovalentes / Connection activity of muscarinic receptor: influence of the monovalent ions

Muchas funciones biológicas y muchos mecanismos de control tales como las reacciones enzimáticas y las interacciones de receptores con neurotransmisores y hormonas, se activan luego de pequeños ligandos se unen a macromoléculas. Es por eso importante comprender cómo la concentración de un ligando puede afectar la respuesta biológica, e imprescindible conocer a fondo los factores que afectan esta relación ligando-receptor la cual inicia los cambios que se producen en la fisiología celular. Así, en este trabajo se estudió el efecto del Na y del Li sobre la capacidad de enlace del benzilato de quinuclidinilo (QNB) con el receptor muscarínico de la acetilcolina (ACh) presente en fracciones de membrana de músculo liso de tráquea de bovino. El QNB es un antagonista de la ACh y se ha demostrado que su actividad de enlace con el receptor muscarínico presenta una alta afinidad, es específica y es saturable. Del análisis de Hill para los experimentos realizados con el D-L-3H-QNB en condiciones basales resultó una constante (Ka) de 1,52nM y un número de Hill (NH) de 1,30. La adición de Na y Li aumentó la capacidad máxima de unión del sistema, el valor del NH fue de 1,61 cuando se agregó NaCI y 1,27 cuando se agregó LiCl. En los experimentos realizados con el L-3H-QNB en condiciones basales se encontró un valor de NH 1,29. Este valor es similar al encontrado cuando se usó el racemato. Por otra parte, al igual que con el D-L-3H-QNB, la adición de NaCl aumenta la cantidad máxima de ligando que puede unirse a los receptores muscarínicos, mientras que la adición de LiCl no la modifica de manera apreciable ..

Biochemical and pharmacological characterization of octylglucoside-solubilized muscarinic receptors derived from bovine tracheal smooth muscle

La actividad de receptor colinérgico muscarínico fue investigada en las fracciones subcelulares del músculo liso traqueal de bovino. Esta actividad de receptor muscarínico fue determinada mediante un ensayo basado en la unión específica del H-QNB (antagonista muscarínico Bencilato de Quinuclidinilo tritiado) utilizando un método simple y reproducible que permite separar el ligando radioactivo que se encuentra libre del unido, mediante un procedimiento de centrifugación en columnas; lo cual permite obtener valores muy bajos como "blanco". Esta actividad de receptor muscarínico fue encontrada enriquecida 4 veces en la fracción microsomal (P) con respecto al Extracto original y después de una etapa adicional de purificación utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa se concentró 7 veces dicha actividad en la fracción de membranas plasmáticas (P-1). A partir de esta fracción de membranas plasmáticas enriquecida en receptor muscarínico y utilizando un método original que emplea un detergente no iónico como es el Octilglucósido al 1% se obtuvo una fracción de receptor muscarínico "solubilizado", después de centrifugar a 200.000 x g x 30 min. El material solubilizado fue filtrado a través de una columna de Sephadex G-50, con la finalidad de remover el detergente y el eluente obtenido de esta columna se denominó receptor muscarínico "solubilizado". El procedimiento descrito inicialmente para evaluar la interacción entre el receptor muscarínico y el H-QNB, también permite determinar bajo las mismas condiciones experimentales, la unión del H-QNB, tanto a los receptores muscarínicos unidos a las membranas plasmáticas como a los receptores presentes en el "solubilizado". Se encontró que el receptor muscarínico "solubilizado" y el asociado a las membranas plasmáticas mostraron idénticas propiedades bioquímicas y farmacológicas